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细胞转染实验解决方案

发布日期:2015年10月14日   浏览次数17176

  要通过克隆化基因生产名副其实的真核生物活性蛋白,往往需要进行翻译后加工,像二硫键的形成、糖基化、磷酸化等等。受到自然界原核生物经常分享遗传物质的启发,人们开始将一些外源分子如DNA、RNA、蛋白等分子导入真核细胞中,细胞转染技术应运而生,尤其在研究基因功能、基因治疗、基因表达调控的时候会经常使用此技术。
  细胞转染技术又分瞬时转染和稳定转染,这是根据具体的实验目的来决定的。转染方法中最常用的是阳离子脂质体方法,它的适用性广,适于所有细胞的稳定转染或瞬时转染,转染效率高,重复性好,操作简单方便。但是不同的细胞,转染效果差别很大,这与转染试剂的特性有关。所以选择一款合适的转染试剂对实验的成败非常关键。
  天根公司目前有三款转染试剂(Lipofect,DNAfectin,RNAfectin),均为阳离子脂质体转染试剂,可对多种类型的细胞达到较高的转染效率,在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时,它可以形成微小的(平均大小约100-400nm)单层脂质体。这些脂质体带正电,可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面,从而将俘获的DNA导入培养的细胞。


Lipofect转染试剂(RM201)
★ 既可用作DNA转染,也可用作RNA转染
★ 可在血清存在的情况下进行转染,转染后无需除去转染试剂
★ 操作简单快速
★ 转染效率稳定高效

应用过的细胞类型

 

DNAfectin转染试剂 (RM202)

★ 适用于将DNA转染入真核细胞
★ 独特的DNA专用配方使复合体的形成更高效
★ 更易于复合体结合到细胞膜表面
★ 毒性更低,转染效率更高
★ 对大多数细胞都可高效转染

 

RNAfectin转染试剂 (RM203)

★ 适用于将RNA转染入真核细胞
★ 独特的RNA专用配方使复合体的形成更高效
★ 更易于复合体结合到细胞膜表面
★ 毒性更低,转染效率更高
★ 对大多数细胞都可高效转染

 

实验注意事项


转染实验的成败与众多因素的影响有关,包括细胞状态、血清选择、抗生素的加入、启动子的选择、核酸的质量、复合物的形成比例、试剂保存等等。
1)细胞状态:建议传代细胞传到第三代左右时就进行转染,取对数生长期状态良好的细胞。贴壁细胞的细胞铺板密度建议在70-90%,悬浮细胞铺板密度在2×106-4×106/ml。根据细胞类型和培养基类型,选择合适的稳定的培养温度、湿度和CO2浓度,整个实验过程需要严格的无菌操作,防止细菌、支原体、真菌等的污染。
2)血清选择:选择质量稳定的血清,在稀释质粒和转染试剂时要用无血清的培养基稀释,否则会影响复合物形成的效率,从而影响转染效率。尽量在无血清条件下进行转染,转染效率会比较高。转染后换成新鲜的培养基进行细胞培养,可以有效提供细胞的存活率。
3)抗生素的加入:在转染培养基、细胞铺板培养基、稳定转染时的选择性培养基中避免使用抗生素,因为这些抗生素会降低转染效率。
4)启动子的选择:对于稳定转染最好选择诱导型启动子,对于瞬时转染可选择组成型启动子。

5)核酸的质量:核酸的纯度直接影响到转染的效率。建议在质粒转染的时候,尽量用高纯的质粒提取试剂盒。尤其是转染原代细胞、悬浮细胞等难转染的细胞,甚至要用无内毒素的质粒提取试剂盒。建议提取质粒的浓度最好是1ug/ul,至少在500ng/ul以上。
6)复合物的形成比例:第一次实验时一定要做一个梯度实验摸索合适的核酸与转染试剂的比例。一般说明书上会有一个建议值范围,但那主要是针对常规细胞种类的实验建议值。由于细胞种类很多,转染的难易程度也不一样,为了确保转染效率,希望针对自己的细胞类型做好梯度条件的摸索。每款试剂本身的配方特点有所差异,即使是一种细胞,用不同转染试剂转染时,这个比例还需要再做略微的调整。
7)试剂保存:转染试剂必须在4度保存,无论是从送货员手中接到货品,还是在整个实验过程中必须在4度条件保存试剂,否则转染效率会受到很大的影响。

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