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miRNA的提取和RT-qPCR鉴定

发布日期:2016年07月05日   浏览次数1284

miRNA的提取

miRNA的提取方法主要分为两大类:1.提取样品中的总RNA后,通过PAGE电泳或PEG将总RNA中的小片段RNA分离出来,最后对小片段的RNA进行沉淀回收,从而获得miRNA2.在适宜的乙醇使用量下,特殊硅基质吸附材料可特异吸附小片段RNA(小于200 nt),经过洗脱最终得到miRNA溶液。手工提取miRNA通常采用第一种方法,而miRNA提取试剂盒一般选择后者。前者的主要缺点在于实验步骤较为繁琐,影响实验结果的因素较多,最终获得的miRNA溶液纯度较差,易对下游实验起抑制作用;而后者方法的操作简便,miRNA纯度良好,但价格稍高于前者。值得注意的是,有报道证明,不同方法提取miRNA会导致不同的结果,硅基质吸附法提取得到的miRNA定量更加准确。

获得的miRNA溶液应置于-20-80保存,避免反复冻融,以避免miRNA降解。通常紫外分光光度计检测的结果并不能准确反应miRNA的含量,一方面因为溶液中含有的miRNA量较低,溶液的OD260无法正确的反映出溶液中核酸的含量;另一方面因为无论采用哪一种方法获取的miRNA溶液中均含有其他小片段的RNA(如snRNA5SRNA等),所以测定的OD260miRNA和其他小片段RNA混合物的吸光值,而不是单纯miRNA的吸光值。

 

miRcute miRNA 提取分离试剂盒(DP501/502/503

miRcute miRNA 提取分离试剂盒是专门针对miRNA 提取而开发的试剂盒,可以同时提取miRNAsmall interfering RNA(siRNA)small nuclear RNA (snRNA) 等小RNA。该系列试剂盒适用于各种样本(细胞,动物组织,植物组织,血清,血浆,FFPE 等)中小RNA 的提取,不同的样本配有不同成分的裂解液及不同的操作流程,并采用特殊的硅基质膜填料离心柱,大大增强了对RNA、尤其是小RNA (<200nt) 的吸附能力,一个小时内即可完成实验,获得的RNA 纯度更好,质量更高。此外,该系列试剂盒采用不同的操作流程可以分别提取总RNA miRNA,配合不同实验目的的需要。

 

用试剂盒(膜纯化法)提取miRNA 的一般流程

适用于:细胞、动物组织、植物组织、血清、血浆、FFPE

分离RNA 片段范围:< 200 nt

 

使用膜纯化法与传统异丙醇沉淀纯化方法的比较

 

实验例

采用TIANGEN 公司DP503 提取200 μl 血清/ 血浆中miRNA

 

 

miRNA 反转录:miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒(KR201/ miRcute 增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒(KR211

miRNA 的长度很短,仅有18-25 个核苷酸,因此无法采用普通的反转录方法和荧光定量PCR 检测,需人为延长其序列。加尾反转录法利用poly(A) 聚合酶为成熟的miRNA 加上多聚A 尾,然后采用在5’ 端具有Universal Tag 序列的Oligo-d(T) 作为反转录引物,获得人为加长的miRNA cDNA 第一链,最后利用与Universal Tag 序列反向互补的反向引物进行染料法的荧光定量PCR 检测。加尾反转录法实验速度快、实验精准、检测通量高,被全世界大量实验室所采用,成为miRNA 反转录和荧光定量PCR 检测中的主要方法。加尾反转录法对成熟miRNA 进行反转录,最终生成miRNA 对应的cDNA 第一链。该试剂盒可采用total RNA miRNA 作为模板,包含了miRNA 3’ 末端Poly(A) 修饰过程和逆转录过程的所有试剂,具有高效的Poly(A) 修饰和逆转录效率,可从20 pg-2 μg totalRNA 中高效制备miRNA 对应的cDNA 第一链。

 

 

miRNA 荧光定量:miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒(FP401/ miRcute 增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒(FP411

该试剂盒采用SYBR Green I 嵌合荧光法的原理进行miRNA 荧光定量检测。试剂盒内包含miRNA 荧光定量检测所需要的2×miRcute miRNA Premix 和与miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒(KR201/211)配合使用的Reverse Primer2×miRcute miRNA Premix(含SYBRROX)是专门为miRNA 定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR 检测试剂,采用特别修饰的热启动DNA Polymerase 和针对miRNA 荧光定量PCR 检测所特制的Buffer 体系,使检测反应特异性更好,灵敏度更高,且在模板大浓度梯度范围具有优秀的线性关系。配搭优化好的miRNA 荧光定量上游检测引物,轻松实现成熟miRNA 的检测。

 

miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒适合的仪器

Applied Biosystems 公司:PRISM7000/7300/7500/7700/7900HT7500FastStep one/Step one plus PCR SystemViiA7

Roche 公司:LightCycler 系列

Bio-rad 公司:CFX96

Stratagene 公司: Mx3000PMx3005P Mx4000

Eppendorf 公司:Mastercycler ep realplex

BioerLine-Gen

Bio-radiCycler IQ/MyiQ/iQ5/CFX96

及其它各种Real Time PCR 扩增仪。

地址:北京市海淀区西小口路66号东升科技园(北领地)C7-3 电话:800-990-6057
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