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miRNA提取检测的常见问题

发布日期:2016年07月05日   浏览次数1717

QmiRcute miRNA提取分离试剂盒(DP501)适于那些样本的提取?

A:本试剂盒可以提取细胞、组织、血清或血浆、植物组织中的miRNA

 

Q:提取血清/血浆样本时,应如何优化实验?

A:提取血清/血浆样本时,可做如下优化:

1.    使用DP501,样本和裂解液MZ的比例从11提升为15

2.    使用DP501,选择提取带有小RNA的总RNA的操作方案。

3.    直接使用miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒(DP503)进行提取。

 

Q:柱法miRNA提取分离试剂盒(DP501/502/503)对比TRNzol试剂,提取的miRNA有何区别?

ATRNzol方法提取需要的样本量较大,miRcute miRNA提取分离试剂盒需要的样本量较少,可用于少量/微量珍贵样本提取。使用TRNzol方法提取的RNA中可能会有酚和盐的残留,对于后续的反转录等实验具有抑制作用,易造成后续实验的失败。对比数据表明,利用柱法提取的miRNA可显著降低酚和盐的残留。而用TRNzol方法提取的总RNA盐含量较高(下图吸光值代表盐浓度)。

 

Q:使用miRcute miRNA提取分离系列试剂盒所提取的miRNA是否建议测取浓度?

A 对于组织、细胞等样本来说,使用DP501提取的<200 nt的产物电泳检测会出现明亮的条带,但产物中更多的是5SRNA5.8SRNAtRNA,因此使用紫外分光光度计检测此溶液的吸光值并不能真正代表产物中miRNA的含量。而对于血清或血浆样本,miRNA提取后则不建议进行电泳检测,因为循环核酸含量较低,电泳很难看到条带;而且,通过紫外分光光度计检测出的miRNA浓度也是不可靠的,应进行灵敏度更高的荧光定量检测。

 

QmiRNA逆转录采用poly(A)尾的方法和茎环法有何区别?加尾法反转有何优点?

A:两者的反转录引物识别原理不同,导致的区别有:

1.    poly(A)尾的方法一个逆转录产物可后续进行多miRNA检测。茎环法一次逆转录只可检测一个特定miRNA,若进行多miRNA检测,则需要针对不同的miRNA设计和优化特异颈环引物和MGB探针。

2.    poly(A)尾的方法内参和目的miRNA在同一体系内反转录,对比定量更准确;而茎环法内参与目的miRNA分开反转录,有可能造成加样误差,定量不准确。

3.    poly(A)尾的方法灵敏度较颈环法逆转录高,茎环法逆转录特异性较加poly(A)尾的逆转录方法更强。

4.    poly(A)尾的方法操作简单,速度快,所需时间成本和物质成本都比较低。

 

Q:加poly(A)尾法反转录及检测成熟miRNA时,是怎样避免miRNA前体扩增的?

AmiRNA前体呈现空间的发夹结构特征,其3’端为双链。加poly(A)尾法的miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR201/KR211)采用单链依赖的加尾酶(PolyA Polymerase),在加poly(A)尾的反应中与双链不发生相互作用,前体无法加尾,从而避免了前体的进一步逆转录和扩增。而且,试剂盒中使用的Quant RTase也是单链依赖的转逆录酶,最大限度的避免了前体的扩增。

 

Q:加poly(A)尾法miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR201/KR211)配搭SYBR GreenmiRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(FP401/FP411)的检测灵敏度如何?

AFP401采用抗体封闭的热启动酶,FP411采用化学修饰的热启动酶,两者都具有优秀的灵敏度,可以从低至5 pgRNA中检测到miRNA(茎环法最低从约25 pgRNA中检测miRNA)

 

Q:使用加poly(A)尾法miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR201/KR211),如何保证检测的特异性?

A:虽然茎环法反转录的特异性稍弱于加尾法,但是可以在荧光定量层面进行补充。miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(FP411)采用新一代化学修饰的PCR聚合酶,具有超高特异性,配合TIANGENmiRNA上游检测引物(CD201/CD202系列),能够区分单个碱基的差异,满足对特异性要求高的实验需要。

 

QTIANGEN的普通型miRNApoly(A)尾和荧光定量试剂盒(KR201/FP401)能否配搭增强型试剂盒(KR211/FP411)使用?

A:普通型和增强型试剂盒主要是酶和缓冲液成分不同,引物都是通用的。使用KR201加尾反转之后,用FP401/FP411均可以进行定量实验。同样,使用KR211加尾反转之后,也同样可以使用FP401FP411进行定量实验。两种试剂盒对于上游检测引物的使用也是同样的。

 

QmiRNA检测外参(CR100-01)与内参有何区别?如何使用?

AmiRNA检测外参是一段线虫的miRNA,用于内参表达不稳定的液相样本(血清/血浆/尿液等)中miRNA的相对定量使用。目的样本中不应包含细胞,对于带有细胞的样本(如全血)或者组织/细胞等样本建议选择U65S等短链非编码RNA作为内参进行定量。外参使用方法是:在miRNA提取过程中,在目的样本裂解后,将一定量的检测外参加入到裂解体系中,之后完成余下的提取步骤。在反转录之后,以miRNA外参上游检测引物(CD200)进行外参的荧光定量,以外参的定量结果归一化不同的样本。外参的起始加入量为1 pmol,再根据预实验的Ct值进行调整。

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