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专家教你攻克植物样本

发布日期:2016年07月26日   浏览次数3236

相信大家在研究过程中总会遇到一些「奇葩」样本,他们就像拦路虎一样,总是在找我们的麻烦。不是提取得率低,就是降解,又抑或是有杂质残留。这些样本躲又躲不开,绕又绕不过,提还提不出来简直就是烦死个人!

其实没那么复杂,静下心来仔细思考一下提取过程就能理出一条线索,解决这个问题。首先是样本的裂解或者破碎,很多疑难样本在这一步就已经挡在了我们的面前,比如某些植物的根部以及较为坚韧的茎部等。这些样本破碎起来特别困难,尤其是当大量样品需要处理的时候,我们经常会选择通量较高的钢珠打样器,当然还有传统的液氮研磨,但这两种方法要么费时间,要么打不透,这个时候我们就需要一些新的思路,比如使用纤维素酶或者果胶酶处理,电动组织研磨器等等。

破碎之后我们需要裂解细胞,目前常用的方法有 SDS(十二烷基硫酸钠)法和 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法,SDS 法比较温和,容易保证 DNA 的完整性,而 CTAB 法则较为强烈,当植物样本成分复杂,多糖多酚含量较高时,一般会选用 CTAB 来进行裂解。

而核酸沉淀则一般使用乙醇或异丙醇,乙醇是首选的有机试剂,对盐类沉淀少,DNA沉淀中所含的痕量乙醇易于挥发。乙醇沉淀核酸时需要加NaAc,或NaCl至最终浓度0.1-0.25 M,中和核酸的电荷有助于核酸形成沉淀。而异丙醇沉淀所需容积小,沉淀速度快。但易使盐类与核酸共沉淀,在核酸沉淀中异丙醇不易挥发。大家可以根据自己的需要来调整。

在保存核酸的时候需要注意,核酸为两性解离分子,在碱性条件下较稳定,一般用TEpH 8.0)保存。为避免核酸降解,提取的核酸应先分装,然后置于-80保存,此条件下可保存5年以上,同时避免反复冻融。

我们来看几个比较难提的样本,首先是茶树。我们要提的是茶树根中的基因组,而且是多年生的老根。这种样本木质化极为严重,非常坚硬难以破碎,次级代谢产物如多糖多酚含量较高,DNA含量较低。解决方案基本思路是利用液氮研磨,CTAB裂解,裂解液中NaCl的量翻倍,并加入了PVP,尽量减小酚类对核酸的影响。同时,由于根部细胞木质化严重,核酸含量较少,为了更大效率的获得核酸,我们用了硅基质膜包裹的磁珠,就是这样。最后我们得出的结果是这样的。

1 茶树根提取结果

火龙果的果皮是一种较为多糖多酚含量较高的样本,同时由于存在大量果胶和纤维蛋白,导致样本磨碎形成匀浆之后极为粘稠。这种粘稠的形态会极大影响裂解液对于吸附柱的通过率,甚至于堵住硅基质膜难以离心。同时,粘稠的样本会降低柱膜对裂解液中核酸的吸附效率,所以需要解决的主要问题就是降低其粘稠性。通过大面积的调整试剂,利用TIANGEN已有的裂解液HL配合CTAB,并向其中加入了少量蛋白酶K,大大降低了溶液粘稠度,可以顺利地从柱膜上洗脱,结果如下。

2 火龙果果皮提取结果

下面还有一些我们对其他样本提取的建议。

小麦种子:样品影响DNA提取质量的因素有很多,主要为蛋白质、多酚、多糖、脂质等。措施:向传统SDS 提取液中加入DTT和可溶性PVP,用醋酸钠替代氯化钠降低pH值。SDS置于65度预热,裂解时放置于65度。

果肉:含水量较大,核酸得率低,果肉中水解酶以及核酸酶大量累积易降解,蛋白质,糖、酚含量较高。措施:脱水或加大样本量,充分研磨。可使用CTAB提取,提取时向裂解液中加入少量β-巯基乙醇,加入NaAc降低裂解液pH保证提取环境。

叶绿体:叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器,作为半自主系统具有DNA,需要去除其他部分提取。措施:蔗糖密度梯度离心法、Percoll 密度梯度离心法。利用不同密度的离心梯度液分离,利用常规SDS法提取DNA

TIANGEN公司作为国内核酸提取领域的龙头企业,积累了大量的核酸提取经验,我们将为各类提供最专业的服务。

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