TIANGEN致力于提供全套成熟的miRNA检测方案。实验者使用TIANGEN配套的miRNA提取(DP501/502/503)、逆转录(KR201/211)、荧光定量(FP401/411)试剂盒，只需自备miRNA荧光定量上游检测引物即可完成整个实验。同时，TIANGEN也提供验证好的部分热门miRNA荧光定量上游检测引物（列表不断扩充中），使实验更加快捷，结果更加准确。当然，实验者也可以根据一定的原则，自行设计miRNA定量上游引物。

设计miRNA荧光定量上游检测引物，首先需通过英国著名miRNA数据库网站miRBase （http://www.mirbase.org/）检索成熟miRNA序列。在miRBase上可获得目前已经公布的各个物种的microRNA具体序列、基因分布、详细序列注册信息，可以通过浏览或搜索的方式查询目的miRNA。

miRNA 上游荧光定量检测引物设计原则

原则一：遵循引物设计的普遍原则。

■ 选择高度保守，碱基分布均匀的靶序列；

■ 引物长度通常为20-30 bp，Tm值通常55-65℃并尽量保证上下游引物温度一致，GC含量在40-60%之间，产物大小在50-250 bp；

■ 选用△G3’端低，5’端和中间相对较高的引物；

■ 避免出现连续3个以上的相同碱基；

■ 引物二聚体及发夹结构的能值不能过高△G（自由能）绝对值不超过6 kcal/mol。

原则二：以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是基础的设计方法。

原则三：试剂盒中提供的下游引物的Tm值为65℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在60-65℃。

使用PrimerPremier，Oligo，PrimerExpress等常用序列分析软件判断引物GC含量、自身是否形成发夹、或引物间是否有折叠等非特异结构。FP401及FP411试剂盒中配搭的Reverse Primer是综合多物种序列特异性设计而成的，和上游引物形成非特异结合的概率很低，在引物过程只考虑上游引物自身的特异结合即可。

若按照原则二的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基(G或C为主)；

例：hsa-miR-1序列为TGGAATGTAAAGAAGTATGTAT，经软件分析不存在非特异结构，但Tm偏低，根据miRNA上游引物设计法则，在引物5’端逐一随机加入碱基（G或C为主），逐一碱基加入核查后的Tm及非特异折叠，使上下游Tm可以匹配。调整后Primer：GCGTCCTGGAATGTAAAGAAGTATGTAT

若按照原则二的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。

例：hsa-miR-23a-5p序列为GGGGTTCCTGGGGATGGGATTT。经软件分析不存在非特异结构，但Tm偏高，根据miRNA上游引物设计法则，在引物5’端始，逐一随机删除碱基，并逐一核查每一碱基删除后的Tm及非特异折叠，直至上下游Tm可以匹配。调整后Primer：GGTTCCTGGGGATGGGATTT

若按照原则二的方式直接设计的引物在做荧光定量时产生严重的引物二聚体，且存在自身4碱基以上发夹或上游引物间二聚体可将5’端非特异结合部分1-2碱基颠换为其他碱基，使特异性增强。

例：hsa-miR-7070序列为CATCTTACCGGGCAGCATTAGA。经软件分析存在非特异结构，且Tm偏低，将4碱基以上非特异结合部位碱基进行颠换，解决非特异问题后，在5’端加入碱基使上下游Tm可以匹配。

调整后Primer：GCAACTTACCTGGCAGCATTAGA

同源性很强的miRNA上游检测引物设计：

例：某小鼠miRNA同源序列为：

a:UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG

b:UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG

通过上游引物设计使这两个序列通过荧光定量的方法进行区分。自3’端开始查找两序列首个相异的碱基，取此碱基作为引物的3’末端或以该碱基之后的2-3个碱基为引物的3’末端，其余序列舍弃。之后在5’端逐一核查加入碱基，使上下游Tm可以匹配。设计的引物要用人工合成的miRNA的cDNA进行交叉验证。

调整后Primera:GCTCAGTCAGGCCTACCCTGTAGAT

调整后Primerb:GCTCAGTCAGGCCTACCCTGTAGAA

引物设计完毕后，还需经过miRbase进一步验证：