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【天根助力IF10+文章】方案思路设计好,高分文章跑不了

发布时间: 2022-06-28 浏览量:0

2022年4月,南通大学生命科学学院杨小龙博士在JOURNAL OF HAZARDOUS MATERIALS期刊(IF:10.588)发表研究论文,着重研究了不同氮形态(硝酸盐和铵)对铜绿微囊藻生理和转录组学的影响。天根生化为本研究提供原核转录组测序及分析服务。

论 文 图 形 摘 要 ✦

研 究 背 景 ✦

氮在蓝藻水华全球扩散中的关键作用正引起越来越多的关注,然而,藻类对不同氮形态的响应机制仍不清楚。本研究着重研究了不同氮形态(硝酸盐和铵)对铜绿微囊藻生理和转录组学的影响。

实 验 材 料 ✦

铜绿假单胞菌(FACHB-905菌株)

方 案 设 计 ✦

  • 蓝藻细胞在氮饥饿培养,耗尽细胞内的氮储存;

  • 不同氮源:硝酸盐或铵作为唯一氮源;

  • 不同浓度:2 mg-N/L和10 mg-N/L;

  • 不同时间节点:在14天的培养过程中,前8天每天采集20毫升培养物,之后,每两天采集一次样本。

注:培养2天后,所有2 mg-N/L组的氮含量均耗尽。为了进一步研究再次经历氮饥饿的铜绿假单胞菌对相同氮形态的生长反应,在第五天将这些组中的氮浓度重新调整为初始浓度。

研 究 结 果 ✦

01

细胞生长和氮素利用特性

在本研究中,当氮源受限制时,铵态氮比硝酸盐更容易刺激铜绿假单胞菌的初始生长。即使当细胞再次缺乏氮时,再添加氮源后,氨组相对于硝酸盐组也观察到快速生长。当以铵态氮供应充足的培养时间延长时,从第5天开始的7天内,铜绿假单胞菌的生长变慢,而在同一时期观察到硝酸盐组促进了生长,是铵处理的1.36倍。同时测定培养液中氮含量的变化,结果显示与细胞的生长结果一致。

图1. 不同氮营养条件下铜绿假单胞菌生长和氮利用的变化。


02

生理性能

光合氧释放

铜绿假单胞菌对铵供应的快速生长反应,培养一天后,所有铵组的净光合速率迅速增加,显著高于硝酸盐组。然而,在培养基中的氮含量耗尽后,2 mg/L氮处理组Pn值开始下降。这进一步强调了光合作用和氮代谢之间的密切关系。在10 mg-N/L组中,充足的硝酸盐供应确保了Pn的持续增加,之后由于氮耗尽,Pn降低。然而,氨氮处理的Pn在两天后急剧下降,一直低于初始值直到培养结束。这表明细胞周围过量的铵离子含量导致绿脓杆菌光合作用的下调。综合分析,将氧释放的减少可能归因于两个方面:一是由于过量的光能积累导致PSII的下调,另一个是通过与铵离子和水分子之间的OEC结合位点的竞争减少光驱动的水氧化。

图2. 不同氮营养条件下铜绿假单胞菌光合放氧(Pn)和饱和辐照度(Isat)的变化。


MC微囊藻毒素生产

测定每个样本的MC产量,并将其计算为细胞配额值。结果表明硝酸盐培养有利于MC的生物合成,氮饥饿诱导毒素产生。当提供足够的氮时,硝酸盐下的MC总量在培养期间没有显著变化,但过量的铵会导致细胞内MC释放到环境中。

图3:不同氮营养条件下铜绿微囊藻胞内MC和胞外MC的变化


03

铜绿假单胞菌的转录组学特征

当环境中氮的浓度和形态随着营养条件的改变,细胞内氮代谢途径也相应改变。转录组分析结果表明,在硝酸盐培养的铜绿假单胞菌和氨氮培养的铜绿假单胞菌之间,超过14%的总基因表达存在显著差异。其中,400个基因上调,365个基因在硝酸盐条件下相对于铵态氮水平下调(图4A)。DEGs的层次聚类显示,具有类似功能或参与相同生物过程的基因聚集在同一组中,并且在组内的样本中观察到DEGs表达的重复性较好。


DEGs的GO和KEGG富集分析

对差异表达基因进行GO富集分析,结果表明,493个DEG主要注释为21个GO功能分类。在生物过程类别中,含有大量DEG的次要功能是金属过程、细胞过程、生长和对刺激的反应,其中基因数量占所有富集基因的30.22%。细胞成分类别中,其中更多的基因富集在细胞和膜类别中。分子功能类别,其中51个基因在分子功能分支中高度富集。


KEGG富集分析结果显示,217个DEG被分别富集到85个KEGG通路中。其中67.28%基因在代谢通路中富集,包括能量代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢等。此外,还富集到很多代谢途径,如ABC转运体、氧化磷酸化、光合作用,脂肪酸生物合成等等。

图4. 在硝酸盐上生长的铜绿假单胞菌中DEGs的聚类、GO网络分析和KEGG富集。


氮代谢的分子调控

蓝藻含有吸收不同氮营养素的特定转运蛋白。编码ABC型硝酸盐/亚硝酸盐转运体的nrtABCD基因、编码铁氧还蛋白-亚硝酸盐还原酶的nirA基因、narB基因和铁氧还蛋白-硝酸还原酶基因的表达在硝酸盐环境下上调。这些基因通常存在于一个操纵子中,控制硝酸盐的吸收和同化。在氮的储存方面,生长在硝酸盐上的铜绿假单胞菌最为突出。该操纵子可能存在于铜绿假单胞菌中。然而,与聚球藻和鱼腥藻不同,在铜绿假单胞菌中未检测到glnKnifI的表达,并且glnB的转录水平未发生差异性改变。铜绿假单胞菌PII及其编码基因的功能有待进一步研究。


光合作用的分子调控

当向绿脓杆菌提供硝酸盐时,光合作用相关基因的表达通常上调,与生长和生理变化一致。有趣的是,在铵胁迫下,铜绿假单胞菌光合作用不良的情况下,几个基因的表达显著上调。氨胁迫下,psbA基因的转录表达上调。psbA编码的D1蛋白是光介导的PSII损伤的主要靶点。因此,psbA的显著上调证实了Pn和Isat的变化所表明的结论,即充足的铵诱导光氧化PSII中的损坏。


RNA-seq结果显示,碳酸氢根转运蛋白和NdhF3~F4复合物,将细胞内CO2转化为铵态氮,相关编码基因上调。这些基因负责CO2 蓝藻中依赖于光能的浓缩机制(CCM),因此,铜绿假单胞菌也通过CCM维持其光合作用中的能量平衡。

图5. 绿脓杆菌氮代谢和光合作用的分子调控网络。


04

发现sRNA目标相互作用

sRNAs通过调控mRNAs的翻译和降解速率,在基因转录后调控中发挥着关键作用。为了更好地了解铜绿假单胞菌如何适应氮供应形式的变化,本研究确定了sRNAs及其靶点。结果表明,在硝酸盐和氨氮条件下培养的铜绿假单胞菌中检测到37个sRNA及其可能的靶蛋白编码基因的表达。然而,只有sRNA00003被注释为已知的蓝藻sRNA,即氮胁迫诱导的RNA 4(NsiR4)。近期有研究表明,NsiR4主要作为转录后调节因子,通过靶向编码GS失活因子7的gifA基因和编码含有DUF4090结构域的未知功能蛋白质的ssr1528基因,在GS的调节中发挥关键作用。然而,NsiR4对不同氮形态的反应目前尚不清楚。

对sRNA进行靶基因预测,并构建互作用网络。在4个sRNA(sRNA0004、sRNA0013、sRNA0022、sRNA0023)的目标中,超过20个。这些靶点涉及多种代谢途径,如氮的运输和储存、光合器官的组装、MC的产生、CO2的固定。这些发现为进一步的研究奠定了坚实的基础,这将为蓝藻如何利用sRNAs整合多种调节途径以响应营养变化提供新的线索。

图6. 调节对氮形态变化适应的sRNA-靶基因相互作用网络图。

结 论  ✦

这项研究是首次将生理信息和转录组学反应结合起来,以探讨铜绿假单胞菌对氮形态的差异反应机制。与硝酸盐相比,铵在刺激氮限制型铜绿假单胞菌的初始生长方面表现更好,而由于过量铵供应造成的PSII损伤,藻类生长和光合作用降低。相比之下,充足的硝酸盐有利于更高的细胞密度和MC配额。硝酸盐培养的铜绿假单胞菌与铵培养的铜绿假单胞菌的基因转录组模式存在显著差异。共检测到765个基因在两种形式的供氮细胞之间差异表达,它们涉及光合能量传递、氮运输和储存、MC生物合成等的调节。特别是,与光能耗散相关的基因被显著上调,以维持高氨氮下细胞内的能量平衡,这为光合作用和氮代谢之间的相互作用提供了新的见解。然而,本研究的主要局限性在于许多新的srna无法在公共数据库中注释,这限制了对铜绿假单胞菌氮代谢和转录后调控机制的进一步研究。

Yang X, Bi Y, Ma X, Dong W, Wang X, Wang S. Transcriptomic analysis dissects the regulatory strategy of toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa under differential nitrogen forms. J Hazard Mater. 2022 Apr 15;428:128276. doi: 10.1016/j.jhazmat.2022.128276. Epub 2022 Jan 13. PMID: 35051775.

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