外泌体提取流程SOP（差速超速离心法）
技术干货-外泌体提取SOP
发布时间： 2026-01-04
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外泌体的生物发生与提取流程SOP
外泌体提取流程（一）— 差速超速离心法
【图注】差速超速离心法六大步骤示意图
1. 样品预处理
收集至少50mL细胞培养上清液或体液样品，在4°C冷藏条件下尽快处理，防止外泌体降解。
- 样品收集：收集至少50mL细胞培养上清液或体液样品。样品应在4°C冷藏条件下尽快处理，避免长时间室温暴露，防止外泌体降解。
- 过滤大颗粒物：使用0.22μm过滤器过滤样品，去除细胞碎片和杂质。确保在无菌条件下操作，以免引入外源污染物。
【图注】0.22μm过滤器过滤样品示意图
2. 低速离心（去除细胞和大颗粒）
将样品置于4°C下，以300×g的速度离心10分钟，去除大细胞和颗粒。
- 取无菌离心管，将过滤后的样品倒入离心管中，确保离心管配平。
- 离心结束后，小心地将上清液转移到新的无菌离心管中，丢弃沉淀。
3. 中速离心（进一步去除细胞碎片）
使用冷冻离心机在4°C下以2,000×g的速度离心20分钟，以去除细胞碎片和较大颗粒。
- 将离心管放置于冰浴中，缓慢地将上清液倒入新的无菌离心管。
- 离心结束后，小心弃去沉淀物，并将上清液转移到新的离心管。
- 保持上清液在冰浴中冷却，以防止外泌体活性下降。
4. 高速离心（去除非外泌体的杂质）
4°C条件下，以10,000×g的速度离心30分钟，进一步去除细胞碎片和较大杂质颗粒。
- 将样品再次过滤后置入新的离心管中，确保离心管配平。
- 离心后，小心转移上清液，弃去沉淀物。此时，上清液中仍可能含有非外泌体的微小颗粒。
5. 超速离心（外泌体沉淀）
以100,000×g的速度在4°C离心90分钟，沉淀外泌体。
- 使用适配的超速离心管，将上清液倒入离心管中，并在离心前确保样品温度为4°C。
- 平衡离心管，放入超速离心机进行离心，速度和时间严格按照参数设置。
- 离心结束后，小心移除上清液，避免干扰沉淀外泌体颗粒。
6. 外泌体洗涤和重悬
使用PBS缓冲液对外泌体进行洗涤，去除杂质并确保外泌体的完整性。
- 在离心管内加入冰冷的无钙镁PBS缓冲液，轻轻涡旋或轻拍管底，重悬外泌体沉淀。
- 重新将样品以100,000×g速度4°C离心70分钟。
- 离心后小心弃去上清液，保留沉淀，并在1mL PBS中轻轻重悬外泌体。
- 外泌体分装保存，短期置于4°C，长期置于-80°C冻存。
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外泌体提取方法对比：经典超离法 vs 磁珠法新技术
经典超离法
差速超速离心法
流程：300xg → 2000xg → 10000xg → 100000xg 梯度离心
优点：纯度尚可，是外泌体提取的经典方法
缺点：耗时久（约4-6小时）、得率有限、需超速离心机
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